互助县001科技特派员工作站开展藏野驴粪便中酵母菌的筛选工作

微生物发酵技术是通过微生物的生理代谢活动，分解或转化饲料中的难消化物质，其中酵母菌因具有安全性和多功能性，成为研究热点。酵母菌不仅能够通过发酵产生丰富的营养成分，还能显著提升饲料的适口性，从而激发动物的食欲。此外，还可以保持肠道微生物群落的稳定，促进机体对营养物质的吸收和利用。酵母菌在其发酵活动中生成了一系列有机酸，如乳酸、乙酸、丙酸等。酵母菌兼性厌氧的特性使其可以在不同的环境条件下生存和繁殖。

一、实验方法

1.粪便的采集

于青海省果洛藏族自治州，采集了藏野驴的新鲜粪便样本。采样前，研究人员用双筒望远镜观察目标动物，待其离开现场后立即开展收集，避免动物活动干扰；所有样本均来自独立野生种群，排除种群间交叉影响。采集过程中，为降低土壤污染，优先选择粪便团块或堆心颗粒，采集部位聚焦粪堆顶部或中心，且每采一份样本更换新的一次性聚乙烯（PE）手套，杜绝交叉污染；样本收集后，装入预先添加约一半体积无菌30%甘油（作为保存液）的25mL采样管中，随后将采样管置于4℃冰箱暂存，进一步保障样本稳定性。所有样本均于每日上午至下午早些时候采集，以减少高温、强风对样本新鲜度的初始影响，为后续分析奠定质量基础。

2.分离纯化

取2 g藏野驴粪便，加入无菌水稀释，静置后取上清液进行梯度稀释，得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释液。取不同梯度的稀释液100 μL，在YPD分离培养基中涂布以挑选酵母菌。

在YPD分离培养基中28 ℃培养48 h~72 h后挑选具有不同形态且符合酵母菌菌落形态的菌株，将其接种于YPD液体培养基，摇晃混匀液体培养基，用接种环在YPD分离培养基上划线接种，重复3~5次直到培养基中菌落形态一致。将纯化后的酵母菌培养液以1:1与30%甘油混合保存于2 ml EP管，放置-80 ℃冰箱内进行保存。

3.酵母菌的分子生物学鉴定

将2 mL左右的种子液加入离心管中，10000 rpm离心2 min，弃上清液富集菌体，使用酵母菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株基因组DNA。以基因组DNA为模板，然后用NL1、NL4和ITS1、ITS4引物PCR扩增酵母的特异性DNA片段，引物序列如下: NL1：（5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’）；NL4：（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）；ITS1:(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)；ITS4：(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。扩增条件设定94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳确认扩增效果和片段大小。将PCR产物送测序公司测序，测序结果应用NCBI Blast在线比对工具对测序结果进行同源性比对。

二、试剂耗材

YPD液体培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，用超纯水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌15 min。

YPD固体培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，用超纯水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌15 min。

YPD分离培养基：YPD固体培养基加入0.1 g/L氯霉素。

酵母菌基因组DNA提取试剂盒；TaqDNApolymeras；Sterilized ddH₂O；电泳缓冲液；琼脂糖；核酸染色剂。

三、结果

从藏野驴粪便中一共筛选出酵母菌18株，其中异常威克汉姆酵母11株，拟浅白长西氏酵母3株，阿德利长西氏酵母1株，液化长崎菌3株。