互助县001科技特派员工作站开展藏羚羊粪便中芽孢杆菌的筛选工作

一、研究背景

青藏高原独特的地理和生态环境孕育了丰富多样的野生动物资源，这些野生动物在长期的适应过程中，其胃肠道内可能形成了独特的微生物群落，其中蕴含着具有潜在价值的益生菌，同时其活动区域受人类活动、农药、抗生素和其他化学污染较小，胃肠道中的益生菌受外界抗性基因的影响可能更小，筛选到安全性较高的益生菌菌株的可能性也就更大。其中芽孢杆菌具有安全性和多功能性，成为研究热点。

二、试验方法

粪便的采集：

本试验藏羚羊粪便采集于青海省玉树藏族自治州曲麻莱县，采样前，研究人员用双筒望远镜观察目标动物，待其离开现场后立即开展收集，避免动物活动干扰；所有样本均来自独立野生种群，排除种群间交叉影响。采集过程中，为降低土壤污染，优先选择粪便团块或堆心颗粒，采集部位聚焦粪堆顶部或中心，且每采一份样本更换新的一次性聚乙烯（PE）手套，杜绝交叉污染；样本收集后，装入预先添加约一半体积无菌30%甘油（作为保存液）的25mL采样管中，随后将采样管置于4℃冰箱暂存，进一步保障样本稳定性。所有样本均于每日上午至下午早些时候采集，以减少高温、强风对样本新鲜度的初始影响。

芽孢杆菌分离纯化：

从采集到的藏羚羊粪便中取2g，加入无菌水稀释，静置后取上清液进行梯度稀释，获得10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释液。取适宜梯度的稀释液100μL，于LB分离培养基中均匀涂布以挑选芽孢杆菌，挑选具有明显水解圈的菌落接种于LB液体培养基中。

摇晃混匀液体培养基，用接种环在LB固体培养基上划线接种，重复3~5次直到培养基中菌落形态一致。将纯化后的芽孢杆菌培养液以1:1与30%甘油混合保存于2 mL EP管，放置-80 ℃冰箱内进行保存。

芽孢杆菌的分子生物学鉴定：

将2 mL左右的种子液加入离心管中，10000 rpm离心2 min，弃上清液富集菌体，使用芽孢杆菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株基因组DNA。以基因组DNA为模板，然后用27f和1492r引物PCR扩增芽孢杆菌的特异性DNA片段，引物序列如下:

 27f：(5-'GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')

1492r：(5-'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')

扩增条件设定为94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；一共30个循环，最后72℃延伸5min。并进行1%琼脂糖凝胶电泳确定扩增效果和片段大小。将PCR产物从测序公司测序，测序结果用NCBI Blast在线比对工具进行同源性比对。

试验耗材：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、超纯水。

固体培养基在上述培养基中添加15g/L琼脂。

LB分离培养基：LB固体培养基加入1%羧甲基纤维素钠。

芽孢杆菌基因组DNA提取试剂盒；亚甲蓝染液；TaqDNApolymeras；Sterilized ddH2O；电泳缓冲液；琼脂糖；核酸染色剂。

三、试验结果：

从藏羚羊粪便中共筛选出19株芽孢杆菌，其中地衣芽孢杆菌4株，解淀粉芽孢杆菌5株，枯草芽孢杆菌3株，耐盐芽孢杆菌1株，贝氏芽孢杆菌3株，蜡样芽孢杆菌1株，苏云金芽孢杆菌1株，索诺拉沙漠芽孢杆菌1株。