互助县001科技特派员工作站开展白唇鹿粪便中酵母菌筛选工作

一、研究背景

微生物发酵技术利用微生物的生理代谢活动分解或转化饲料中的难消化物质。其中，酵母菌因其安全性高、功能多样，已成为研究热点。酵母菌不仅能通过发酵产生丰富的营养成分，显著提升饲料适口性，激发动物食欲；还能维持肠道微生物群落稳定，促进机体对营养物质的吸收利用。在其发酵过程中，酵母菌可产生乳酸、乙酸、丙酸等一系列有机酸。其兼性厌氧特性使其能在不同环境条件下生存和繁殖。

二、实验方法

1. 粪便样本采集

地点： 青海省玉树藏族自治州。

对象： 野生白唇鹿新鲜粪便。

流程：

使用双筒望远镜观察目标动物，确认其离开后立即采集，避免干扰。

所有样本均来自独立野生种群，排除种群间交叉影响。

优先选取粪便团块或堆心颗粒，重点采集粪堆顶部或中心部位，最大限度降低土壤污染风险。

每采集一份样本即更换全新一次性聚乙烯（PE）手套，避免交叉污染。

样本采集后，置于预先添加约一半体积无菌30%甘油（保存液）的25mL采样管中。

采样管暂存于4℃冰箱，保障样本稳定性。

时间： 样本均于每日上午至下午早些时段采集，以减少高温、强风对样本新鲜度的初始影响，确保后续分析质量。

2. 酵母菌分离与纯化

稀释： 取2g白唇鹿粪便样本，加入无菌水稀释，静置后取上清液进行梯度稀释，获得10⁻²至10⁻⁷浓度梯度的稀释液。

涂布分离： 取各梯度稀释液100μL，分别涂布于含氯霉素（0.1 g/L）的YPD分离培养基上。

培养与初筛： 28℃培养48-72小时后，挑选形态各异且符合酵母菌特征的菌落。

纯化： 将初筛菌株接种于YPD液体培养基，振荡混匀后，用接种环在YPD分离培养基上划线纯化，重复3-5次直至获得形态均一的单菌落。

保藏： 将纯化后的酵母菌培养液与30%甘油按1:1比例混合，分装于2mL EP管中，置于-80℃冰箱长期保存。

3. 酵母菌分子生物学鉴定

DNA提取： 取约2mL种子液，10000 rpm离心2分钟富集菌体，弃上清。使用酵母菌基因组DNA提取试剂盒提取目标菌株基因组DNA。

PCR扩增： 以基因组DNA为模板，使用引物对NL1/NL4 (D1/D2区) 和ITS1/ITS4 (ITS区) 进行PCR扩增。

引物序列：

NL1: 5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’

NL4: 5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’

ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

扩增程序： 94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。

电泳确认： 使用1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物扩增效果及片段大小。

测序与比对： 将PCR产物送至测序公司进行测序。利用NCBI Blast在线工具对测序结果进行同源性比对分析。

主要试剂与耗材

YPD液体培养基： 酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，超纯水定容至1000 mL，121℃灭菌15分钟。

YPD固体培养基： YPD液体培养基基础上添加琼脂 15 g/L。

YPD分离培养基： YPD固体培养基基础上添加氯霉素 0.1 g/L。

其他： 酵母菌基因组DNA提取试剂盒；亚甲蓝染液；Taq DNA聚合酶；灭菌双蒸水（ddH₂O）；电泳缓冲液；琼脂糖；核酸染色剂。

三、初步结果

从白唇鹿粪便样本中共筛选获得酵母菌30株。经初步鉴定，其种属分布为：

异常威克汉姆酵母 (Wickerhamomyces anomalus)： 25株

毕赤酵母 (Pichia sp.)： 4株

膜醭毕赤酵母 (Pichia membranifaciens)： 1株