谈重芳 2024-10-14 09:18:51

    采用纸片扩散法进行抗生素敏感性测定，结果判定参照《纸片法抗菌药物敏感试验标准》WS/T 125-1999（表1）。由表2可知，十株菌株对万古霉素、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林均具有敏感性，除菌株YR3.2，其它菌株对利福平具有敏感性。菌株YR3.2、YR2.3、YR4.1对四环素具有耐药性，菌株YR4.1.2、YR2.3B对四环素中度敏感，其余菌株对四环素具有敏感性。菌株YR3.1、YR3.3、YR3.1.2、YR4.3对红霉素具有耐药性，其余菌株对红霉素敏感。菌株YR3.1、YR7.1、YR3.3、YR3.1.2、YR4.3对氯霉素具有中度敏感性，而YR3.2、YR2.3、YR4.1.2、YR2.3B、YR4.1对氯霉素具有敏感性。

谈重芳 2024-10-14 09:18:13

    将酶活力单位（IU）定义为：1 mL 酶液 1 min 内产生 1 μmol 还原糖的酶量作为一个酶活单位。利用 DNS 比色法测定纤维素酶酶活力。分别取 1 mL 粗酶液及溶有 1% CMC-Na 的柠檬酸缓冲液 1.5 mL 依次加入洁净比色管中，在 50 °C恒温水浴锅中保温 30 min，然后迅速向比色管中加入 2.5 mL DNS 溶液并摇匀，促使酶反应终止，混合均匀后沸水浴 5 min，快速冷却后加入超纯水于比色管 10 mL 刻度线处，定容至 10 mL，混匀。在波长为 540 nm 下测定 OD值，以葡萄糖标准曲线求得 CMCA。 取测的重复试验中吸光度的平均值，在葡萄糖标准曲线上计算出其对应的值，根据公式计算出纤维素酶活力（U/mL）。 其中，K 为葡萄糖标准曲线斜率，n 为溶液的稀释倍数，1000 为单位 mg 转化为 μg，180 为 葡萄糖的相对分子质量，t 为显色时间，v 为粗酶液体积。 如图所示，不同菌株酶活性不同，其中菌株YR3.2内切葡聚糖酶酶活最高为54.68U/mL，其次为YR4.1.2、YR2.3、YR2.3B、YR4.1、YR3.1、YR4.3、YR7.1、YR3.3、YR3.1.2，酶活分别为49.38、46.27、44.62、34.75、16.82、14.63、14.45、10.06、8.23U/mL。

谈重芳 2024-10-14 08:58:49

    1乳酸菌复苏 从-80℃冰箱中取出保种的两株菌：乳肠球菌H49(CCTCC NO:M20232102)、乳酸片球菌HZ49(CCTCC NO:M20232103) ，室温融化后准备复苏；按1%的比例加入到10mL MRS液体培养基中，培养24h后再取其菌液加入到新的10mL MRS液体培养基中培养24h，此步骤共重复三次。接着在MRS固体培养基上进行纯化，在倒好的MRS固体培养基平板上划线培养，24h后观察菌落形态，判断有无污染；根据菌落形态挑取单菌落到10mL的MRS液体培养基中，培养24h，培养步骤同上，重复3次。以上所有步骤培养后都要观察细菌生长情况（培养基浑浊程度，平板有无菌落生长），若细菌生长状况差或未生长则重新取另一管保种的细菌进行复苏。 2涂布稀释、计数 按1%的比例将复苏好的细菌接种到400mL的MRS液体培养基中进行扩大培养，培养24h后，取少量菌液混匀，按105，106，107，108，109的倍数进行梯度稀释，于MRS固体培养基上点样进行活菌计数，点样完成后于37℃培养箱中过夜培养，培养完成后进行计数确定菌液浓度，其余菌液放入4℃冰箱中保存备用。

谈重芳 2024-10-14 08:56:52

     1. 合成3对毒力基因引物：cylA、gelE和ace，引物见表1，PCR反应体系同上，扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳30 min。 2. 对筛选到的54株乳酸菌的毒力因子进行基因检测，PCR扩增结果显示（表2），54株乳酸菌均不存在毒力因子相关的cylA基因

谈重芳 2024-10-14 08:55:10

    将筛选后的乳酸菌，37℃液体培养24 h后，固体培养基划线再次培养24h观察单菌落颜色、形状、表面特征、边缘形状、色泽、透明程度、湿润程度等。 如表1所示，21株菌株菌落颜色均为乳白色，均为圆形微隆，乳酸菌菌落表面光滑、湿润，边缘整齐，均表现为不透明。 表1 乳酸菌的形态特征