王稳 2023-11-06 13:47:56

    见上传的附件材料。

王稳 2023-11-06 09:08:49

    共使用34种药敏纸片（均购自上海源叶生物科技有限公司）。药敏纸片上分别有抗生素四环素、复方新诺明、氧氟沙星、新霉素、多粘菌素B、头孢拉定、拉氧头孢钠、苯唑西林、氨曲南、哌拉西林、厄他培南、制霉菌素、诺氟沙星、红霉素、氨苄青霉素、头孢唑林、头孢西丁、头孢呋辛、丁胺卡那、环丙氟哌酸、甲氧苄胺嘧啶、克拉霉素、头孢他啶、左氧氟沙星、吉他霉素、头孢曲松、阿莫西林、强力霉素、林可霉素、克林霉素、妥布霉素、阿奇霉素、青霉素G和链霉素。 对8种分离菌进行34种抗生素的药敏试验。结果显示（下表），这些分离菌对不同抗生素表现出耐药性。其中，海氏肠球菌可耐受16种抗生素，耐久肠球菌可耐受26种抗生素，蒙氏肠球菌可耐受10种抗生素，屎肠球菌可耐受21种抗生素，简单芽孢杆菌可耐受22种抗生素，地衣芽孢杆菌可耐受11种抗生素，蜡样芽孢杆菌可耐受13种抗生素，短短芽孢杆菌可耐受10抗生素。从抗生素的角度，发现有15种抗生素可抑制本研究中1/2的分离菌。而复方新诺明、制霉菌素、林可霉素则对本研究的8种分离菌几无抑制作用。

王稳 2023-11-06 09:06:54

    对8种分离菌株进行了抑菌谱测试。首先对这些菌株的生长情况及肠道内定殖情况进行测试。从生长曲线来看，除短短芽孢杆菌外，其余菌株6~18 h时间段生长速率缓慢，进入稳定期，一直持续到28 h左右。 进一步，设置6个pH梯度和5个胆盐梯度模拟胃肠道环境，测试这8种菌株的存活率。如图所示，除短短芽孢杆菌外，7种菌株在pH值为1~4时，存活率维持在20%左右，说明7种菌株在低pH值环境中，生长受到抑制。但另一方面，在pH值为1~2时，仍然能保持生长，说明8种菌株可以抵抗胃酸环境，进而进入到肠道中实现定殖。当pH值为5~6时，存活率明显恢复。 不同胆盐浓度下菌株的存活率如图所示。胆盐浓度为0.5%时，3种菌株（海氏肠球菌、耐久肠球菌、蒙氏肠球菌）存活率较低，生长被抑制；而其余5种菌株，存活率均在40%以上，说明具有良好的胆盐耐受能力，可以抵抗肠道中的胆盐环境。 经测定，8种分离菌株对5种常见肠道致病菌均表现出一定的抑制效果（下图）。海氏肠球菌、耐久肠球菌、蒙氏肠球菌、屎肠球菌对大肠杆菌抑制效果最好。海氏肠球菌、耐久肠球菌对肠炎沙门氏菌抑制效果最好。简单芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑制效果最好。海氏肠球菌、耐久肠球菌、蜡样芽胞杆菌、短短芽孢杆菌对痢疾志贺氏菌抑制效果最好。海氏肠球菌、耐久肠球菌、蒙氏肠球菌对铜绿假单胞菌抑制效果最好。

王稳 2023-11-06 09:04:15

    在无菌条件下，将采集的新鲜粪便样本，放入1 ml无菌水中，3000 r/min离心5 min。取悬液100 μl，在无菌水中进行10倍梯度稀释，制成10-1至10-9梯度稀释液。分别吸取其中的10-1，10-3，10-5，10-7，10-9稀释液涂布在LB、MRS、M17和LBS琼脂培养基上。在有氧条件下，37℃培养24 ~ 48 h。然后挑取表征（颜色、大小、形状）不同的单菌落于LB、MRS、M17和LBS肉汤中，分别在37℃培养12 h。再将相应肉汤中的菌液涂布至琼脂培养基中，分别进行第二轮纯化培养。如此反复，经过5轮纯化培养后，最终获取单菌落。 按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤，提取上述纯化后的细菌总DNA，利用细菌的16S rRNA基因通用引物（上游引物：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）进行PCR扩增。PCR反应体系为：2 × Taq PCR Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 21 μl，总体积50 μl。PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 2 min，循环35次；72℃ 10 min。4℃保存。分别取7μl上述PCR产物和DL 2000 Marker，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，若检测结果中出现约1500 bp的条带则为阳性。将上述PCR扩增阳性的产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。 将测序结果利用NCBI的BLAST程序进行序列相似性比对，找到同源性最高的序列，进而确定细菌的分类水平。在NCBI中登录细菌的16S rRNA基因序列信息。同属细菌16S rRNA基因的相似性为97% ~ 99%；相似性小于97%的为潜在新菌种；同种不同株的相似性大于99%。运用MEGA X软件，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）对测序获得的16S rRNA基因序列构建系统进化树。 最终得到有潜在应用价值的有益菌株为8株：蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）、海氏肠球菌（Enterococcus hirae）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）。

王稳 2023-11-06 09:01:45

    2023年8月9日，与工作站站长和成员一行赴循化县有机肥生产企业进行座谈与指导，实地查看有机肥生产企业经营规模、现状、生产工艺、目前面临困难，向有机肥生产企业负责人介绍了本工作站研发的微生物菌剂配方，推荐有机肥生产企业后期可免费使用本工作站研发的微生物发酵菌剂进行小范围生产和效果评价、与成本核算。与有机肥生产企业初步达成合作意向，切实解决企业生产和经营中面临的困难。